蛋白質磷酸化實驗原理、主要類型和功能介紹

蛋白質磷酸化是指由蛋白激酶催化，將ATP或GTP的γ位磷酸基團轉移到底物蛋白的氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等）上的過程。蛋白質磷酸化是體內常見的調節(jié)方式，在細胞信號轉導過程中發(fā)揮著重要作用。幾乎所有的蛋白質在合成過程中或合成后都會發(fā)生某種形式的修飾。異常的翻譯后修飾與疾病的發(fā)生有關。某些特定的翻譯后修飾被開發(fā)為疾病的分子標記或治療靶點。最常見和最重要的蛋白質翻譯后修飾，蛋白質磷酸化是將外部刺激轉化為細胞內信號的主要機制。

在磷酸化反應中，在蛋白質的氨基酸側鏈上加入一個帶強負電荷的磷酸基團，引起酯化作用，從而改變其與其他分子相互作用的構型、活性和性能。酯化調節(jié)許多生物過程，例如信號轉導、基因表達和細胞分裂。編碼的蛋白質只會被特定的氨基酸磷酸化。在真核生物中，主要被絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基磷酸化。在細菌中，殘基如天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸磷酸化蛋白質。一些蛋白質在原核生物和真核生物中都被磷酸化，它們的磷酸化位點通常是精氨酸、賴氨酸和半胱氨酸殘基。可逆的蛋白質磷酸化調節(jié)細胞的大部分功能，如能量儲存、形態(tài)變化、蛋白質合成、基因表達、信號因子釋放、肌肉收縮和生化代謝。因此，蛋白質磷酸化分析和位點鑒定已成為蛋白質組學研究的重點之一。

蛋白質磷酸化的主要類型和功能

根據磷酸氨基酸殘基的不同，磷酸化蛋白可分為4類：O-磷酸蛋白、N-磷酸蛋白、酰基磷酸蛋白和S-磷酸蛋白

1. O-磷酸蛋白是由羥基氨基酸（如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸）磷酸化形成的，但羥基脯氨酸或羥基賴氨酸的磷酸化作用尚不清楚。

2. N-磷酸蛋白由精氨酸、賴氨酸或組氨酸的磷酸化形成。

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4. S-磷酸蛋白由半胱氨酸磷酸化形成。

蛋白質磷酸化的功能是多種多樣的

1. 參與其他重要的酶促反應（磷酸化反應產生中間產物，多為S或N磷酸鹽等）

2. 介導蛋白質活性（蛋白質分子通過蛋白激酶的磷酸化改變性能），例如蛋白激酶 A（磷酸化絲氨酸和蘇氨酸殘基）或各種受體酪氨酸激酶（磷酸化酪氨酸殘基）

3. 發(fā)揮多種獨特的生理作用。例如，天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸磷酸化蛋白在細菌趨化反應的感覺傳遞中解離。某些激素也以特定磷酸化蛋白的形式存在于靶組織中。

蛋白質磷酸化的研究方法

近年來，更多的研究集中在蛋白質磷酸化上。一些主題包括確定蛋白質的位點特異性磷酸化、植物蛋白磷酸化和動物神經細胞磷酸化。新的研究方法不斷涌現。最廣泛使用的技術是質譜和同位素標記結合免疫印跡-化學發(fā)光分析。

質譜檢測

質譜法是利用電場和磁場，根據質荷比檢測帶電運動粒子（包括原子、分子甚至分子結構片段）的物理和化學性質的方法。核素的精確質量是小數位數。任何兩種核素的質量都是不同的，一種核素的質量并不完全是另一種核素的整數倍。因此，通過測量帶電粒子（離子）的精確質量，可以確定相應的化合物組成、結構和裂化規(guī)律。

與未修飾的多肽相比，磷酸基修飾的多肽的相對分子質量增加了79.983。磷酸肽的產生意味著片段離子結構可用于診斷，這與未修飾的肽不同。質譜法可用于鑒定蛋白質磷酸化。通過使用特定序列水解酶（如胰蛋白酶）水解凝膠分離的蛋白質，獲得不同的肽。高效液相色譜用于分離感興趣的肽，然后進行質譜分析。

同位素標記結合免疫印跡-化學發(fā)光分析

該方法使用放射性同位素標記、二維電泳和放射自顯影來建立蛋白質組圖。通過免疫印跡持久化學發(fā)光可以選擇性地識別和分析目標蛋白，也可以用于同時比較多個樣品中相同蛋白的表達。

當蛋白質被磷酸化時，放射性 32 P的摻入和分子質量的變化會引起凝膠位移，這使得免疫印跡在分析檢測中占有重要地位。

當化學反應產生的能量以光的形式釋放出來時，稱為化學發(fā)光。例如，最常用的化學發(fā)光試劑之一魯米諾被過氧化物氧化產生氨基鄰苯二甲酸酯。當該產物衰變?yōu)榈湍軕B(tài)時，會釋放出一個光子。使用獲得專利的添加劑來增加發(fā)光強度和發(fā)光反應的持續(xù)時間（穩(wěn)定性），生產了一種增強的化學發(fā)光 (ECL) 試劑。在使用 ECL 的免疫印跡中，當酶和反應底物相互作用時，化學發(fā)光劑會產生可檢測的光。特定抗體在適當稀釋濃度下產生的穩(wěn)定光信號輸出有助于保持蛋白質檢測的一致性和靈敏度。

磷酸化位點鑒定實驗服務-輝駿生物

磷酸化是細胞信號通路中重要的共價翻譯后修飾 (PTM)。這種修飾是一個可逆過程，由蛋白激酶催化。研究表明，超過 30% 的真核蛋白質會發(fā)生磷酸化。磷酸化修飾對靶蛋白主要有兩種調控機制：（1）磷酸化可能引起修飾蛋白如酶、受體等結構的構象變化，從而“開啟”或“關閉”功能。 (2) 磷酸化改變了蛋白質對其效應子的親和力，通過這樣做，磷酸化的蛋白質可以募集或釋放其下游效應子。因此，可以想象磷酸化修飾調節(jié)廣泛的生物活動，例如細胞生長、細胞代謝、細胞分裂等。

磷酸化可能發(fā)生在真核生物中的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和組氨酸殘基上。在這四種類型的磷酸化中，酪氨酸磷酸化是最罕見的，但非常關鍵。最著名的酪氨酸激酶受體位于 MAPK 通路的最上游，調節(jié) Ras 和其他激酶，啟動磷酸化級聯反應。

通過液質聯用技術(LC-MS/MS)結合數據庫檢索，可以對目前已知的各種蛋白修飾類型（如磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化、琥珀?；龋┖鸵恍┬》肿铀幬镌诘鞍咨系男揎椢稽c進行鑒定。